Se puede acceder en automóvil a cualquiera de los seis Centros de Visitantes de las provincias de Sevilla, Huelva o Cádiz y al Punto de información Casa Grande de Aznalcázar.
El acceso al Centro de Visitantes José Antonio Valverde (Aznalcázar, Sevilla) se realiza a través de pistas sin asfaltar. Es recomendable solicitar información previa sobre el mejor acceso a este Centro de Visitantes en cualquier punto de información de Doñana.
Desde Sevilla: se toma la autopista A-49 hacia Huelva. Se abandona en la salida de Bollullos Par del Condado/ La Palma. Desde allí, se toma la carretera A-483 que lleva hacia Almonte, El Rocío y Matalascañas. Asimismo, se puede tomar en la A-49, la salida de Hinojos/Chucena, y la carretera A-481 hacia Hinojos, y de allí la A-484 que lleva hacia Almonte. Desde Almonte, se debe tomar la A-483 hacia El Rocío y Matalascañas.
Desde Huelva: se toma la carretera A-494 que lleva hacia Matalascañas. En Matalascañas, la carretera A-483 lleva hacia El Rocío.
Desde Sevilla o Cádiz: es posible llegar hasta Sanlúcar de Barrameda por las carreteras A-471 (desde Lebrija) y A-480 desde (Jerez de la Frontera).
En autobús se puede acceder a El Rocío, que tiene conexión a pie con el Centro de Visitantes La Rocina. Los Centros de Visitantes Palacio del Acebrón y El Acebuche solo son accesibles en vehículo particular, siendo El Rocío y Matalascañas las poblaciones más cercanas. El Centro de Visitantes Fábrica de Hielo está situado en Sanlúcar de Barrameda (Cádiz), y cuenta con transporte público desde Sevilla y Cádiz.
El Centro de Visitantes José Antonio Valverde (Aznalcázar, Sevilla) solo es accesible en vehículo particular.
La cercanía de la mayor parte de los Centros de Visitantes a zonas urbanas permite el uso de este medio de transporte como alternativa al coche.
El acceso en bicicleta al Centro de Visitantes José Antonio Valverde (Aznalcázar, Sevilla) desde Villamanrique de la Condesa, La Puebla del Río e Isla Mayor, es el mismo que en coche, de unos 25 kilómetros, solo ida. Es aconsejable informarse previamente del estado de las pistas.
Está permitido transitar a pie libremente por los 33 kilómetros de playa del Parque Nacional, entre Sanlúcar de Barrameda y Matalascañas, y las vías pecuarias Raya Real y Camino de Moguer, ambas con inicio en El Rocío. El Parque Nacional dispone asimismo de una red de senderos peatonales de acceso libre (ver información en apdo. 4 Instalaciones y Servicios).